Phos-tag SDS-PAGE database tau

Tau (His-tag, Human, Recombinant)

Non-glycosylated and non-phosphorylated form of the 441 amino acidTau splice variant. Tau is thought to promote normal microtubuleassembly and stabilize microtubules in vivo. Hyperphosphorylated andglycated Tau tends to self-assemble and form paired helical filaments(PHFs), which are the basic structural components of neurofibrillarytangles (NFTs). NFT accumulation correlates with the clinicalprogression of Alzheimer’s Disease.
Mw: 60,000

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各レーンは，以下のチロシンキナーゼによる，Tau の in vitro kinase assayです。
1. kinase なし, 2. Abl, 3. MET, 4. FYN

Tau タンパク質には5つのチロシンTyr-18, -29, -197, -310, -394があります。

FYNはTyr-18をリン酸化することが報告されています。

Mn²⁺–Phos-tag SDS-PAGE で，Abl，MET によってリン酸化されたものが
シフトアップしているのがわかります。
FYNはシフトアップバンドが見られません。

抗リン酸化チロシン抗体(PY20)によるWB より，
３種類のチロシンキナーゼによってTauはチロシンリン酸化されることがわかりました。
Abl とMETについては，シフトアップバンドがリン酸化物ですが
FYNについてはリン酸化していても，シフトアップしないことがわかりました。

Abl とMET によるシフトアップバンドの質量分析から
AblはTyr-394 を，MET はTyr197をリン酸化することがわかりました。

この実験は，次の２つのことを示しています。

Phos-tag SDS-PAGE では分子内のリン酸化数が同じでも
リン酸化部位が異なれば，異なる移動度を示すこと

Mn²⁺–Phos-tag SDS-PAGE ではリン酸化していても
シフトアップしない例があるということ

後者については，Zn²⁺–Phos-tag SDS-PAGEで，その問題点が解決されます。

Related data　

Tau kinase assay(Ser/Thr kinase)

Tau Tyr kinase assay(ABL, MET, FYN)_Zn²⁺-Phos-tag SDS-PAGE

Tau Ser/Thr kinase assay_2D analysis

Reference	Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Matsubara, M., Yamada, S., Nakamura, H., Shiro, Y., Aoki, Y.,Okita, K., and Koike, T. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. *Proteomics*, 8, 2994–3003. (2008) doi: 10.1002/pmic.200800243.
Composition of gel	Mn²⁺–Phos-tag:　80µM Polyacrylamide: 7.5%(w/v)
Detection	1.　SYPRO Ruby stain 2.　WB: anti-pTyr(PY20)

Reference

Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Matsubara, M., Yamada, S., Nakamura, H., Shiro, Y., Aoki, Y.,Okita, K., and Koike, T. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. Proteomics, 8, 2994–3003. (2008)

doi: 10.1002/pmic.200800243.

Composition of gel

Mn²⁺–Phos-tag:　80µM

Polyacrylamide: 7.5%(w/v)

Detection

1.　SYPRO Ruby stain

2.　WB: anti-pTyr(PY20)